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Optimisation du transfert nucléaire chez les poissons

• Nous utilisons le poisson rouge comme modèle en raison de la disponibilité d’ovules de grande qualité tout au long de l’année. Des ovules fraichement ovulés sont stockés dans le liquide cœlomique de de truite, afin d’empêcher l’activation des ovules et la reprise de méiose. Une cellule décongelée issue de culture d’explant de nageoire est injectée par le micropyle dans l’ovule avec un microcapillaire. L’énucléation de l’ovule est complexe et délétère chez le poisson, et la majorité de nos expériences sont réalisées sur ovule non énucléé.
• Nous avons montré que la plupart des milieux couramment injectés avec la cellule somatique (milieu de culture, solution saline) peuvent être toxiques pour le développement embryonnaire, et que le liquide cœlomique de truite est le meilleur vecteur. La cellule doit être injectée au pôle animal où elle subit une libération très rapide de son noyau dans le cytoplasme ovocytaire. Une période de latence avant l’activation des ovules permet d’obtenir de meilleurs taux de développement. Nous faisons l’hypothèse que l’incubation du noyau injecté dans le cytoplasme métaphasique de l’ovule est favorable à la reprogrammation de la chromatine.
• Nous avons montré que la moitié des clones produits sont diploïdes, et que la moitié de ces embryons diploïdes portent exclusivement le génome de la cellule injectée. Cela indique qu’une élimination complète de la chromatine maternelle a eu lieu. Nous avons également observé que la qualité de la première mitose peut prédire le succès de développement du clone, bien que la plupart des dommages ne soient visibles qu’après l’activation du génome embryonnaire.

Reprogrammation de la cellule donneuse avant transfert nucléaire : un levier pour améliorer le succès du clonage

• Après une fécondation classique, la chromatine du spermatozoïde et de l’ovule subit des remaniements structuraux et biochimiques qui vont permettre la mise en route du développement. Une telle reprogrammation va permettre, in fine, une expression conforme des gènes du développement précoce. Quand la chromatine injectée est issue d’une cellule somatique, son profil n’est pas adapté à une telle tâche. Par conséquent, la qualité de la reprogrammation de cette chromatine somatique est un élément clef dans le succès du développement embryonnaire après transfert nucléaire.
• Nous étudions comment cette reprogrammation par l’ovule receveur peut être améliorée par une modification préalable des caractéristiques de la cellule donneuse. La culture de cellules de nageoires a été optimisée pour permettre que les cellules en culture puissent être exposées à des agents reprogrammants préalablement au transfert nucléaire. Notre stratégie la plus récente est de perméabiliser les membranes des cellules de nageoire et de les incuber avec des extraits ovocytaires de xénope. L’objectif est d’induire une sorte de pré-reprogrammation selon un profil embryonnaire du noyau somatique.

Reprogrammation de l’embryon après transfert nucléaire chez les poissons

• Le profil épigénétique de la cellule somatique est très différent de celui d’un spermatozoïde ou d’une cellule embryonnaire. Nous étudions dans quelle mesure l’ovule receveur est capable de reprogrammer le profil épigénétique de la cellule somatique. Nous analysons le profil de méthylation de l’ADN des quelques gènes marqueurs choisis du fait de leur méthylation différentielle entre les cellules somatiques et le sperme ou les cellules embryonnaires. Nous suivons l’évolution de leur profil de méthylation de l’ADN dans les embryons issus de transfert nucléaire.
• La reprise de méiose et l’initiation du développement embryonnaire sont fonctionnelles dans un ovule après fécondation. Après transfert nucléaire, nous recherchons dans quelle mesure ces étapes se mettent en place normalement. Nous étudions la reprise de méiose et les premières mitoses après transfert nucléaire, afin de comprendre la nature et l’importance des altérations induites par le transfert nucléaire lors de ces étapes précoces.